一、色譜柱填裝的目的

色譜柱填裝的目標是把固定相填料均勻、致密、穩定地裝入柱管中，使柱床具有：

高柱效；

低渦流擴散；

合理柱壓；

良好峰形；

穩定保留時間；

長期使用不塌床、不產生空隙。

簡單說，好的填裝柱床應該是：

均勻、緊密、無氣泡、無裂隙、無空洞、無通道。

二、色譜柱的基本結構

一支常規 HPLC 色譜柱通常包括：

柱管

常見材質為不銹鋼、PEEK、玻璃等。

固定相填料

如 C18、C8、硅膠、氨基、氰基、離子交換樹脂、SEC 填料等。

篩板/濾片 frit

防止填料流失，同時保證流體均勻分布。

端接頭/end fitting

固定篩板并連接管路。

柱頭空間

理想情況下應極小，不能有明顯空隙。

三、常見填料類型

1. 按基質分類

硅膠基填料

最常見，例如：

C18；

C8；

Phenyl；

CN；

NH2；

Diol；

HILIC 填料。

優點是柱效高、機械強度好。

缺點是 pH 耐受范圍有限，通常約 pH 2–8，具體看廠家。

聚合物基填料

如聚苯乙烯-二乙烯苯、甲基丙烯酸酯類樹脂。

優點：

pH 范圍寬；

耐強酸強堿；

適合離子交換、SEC、GPC 等。

缺點：

機械強度、柱效有時不如硅膠；

有些填料易溶脹。

瓊脂糖/葡聚糖類軟膠

多用于蛋白純化、親和層析、凝膠過濾。

特點：

壓力耐受低；

填裝時不能高壓壓實；

適合低壓層析系統。

2. 按粒徑分類

常見粒徑：

1.7 μm：UHPLC；

2.6 μm：核殼柱；

3 μm：快速分析；

5 μm：常規 HPLC；

10 μm：半制備/制備；

20–50 μm：中低壓制備；

50–100 μm：開放柱或低壓柱。

粒徑越小：

柱效越高；

柱壓越高；

填裝難度越大；

對設備要求越高。

四、色譜柱填裝方法

常見填裝方式有：

1. 干法填裝

把干燥填料直接加入柱管中，通過振動、敲擊、壓實等方法形成柱床。

常用于：

開放柱；

硅膠柱層析；

中低壓制備柱；

某些大顆粒填料。

優點：

操作簡單；

不需要復雜設備。

缺點：

柱床均勻性較差；

容易產生氣隙；

不適合高效 HPLC 小粒徑填料。

2. 濕法填裝/勻漿填裝

這是 HPLC 和制備液相常用方法。

將填料分散在合適溶劑中，制成勻漿，然后在壓力或流速作用下填入柱管。

優點：

柱床更均勻；

柱效更高；

重現性更好；

適合小粒徑填料。

缺點：

需要填裝裝置；

對溶劑、壓力、勻漿濃度要求較高；

操作不當容易塌床或分層。

五、濕法填裝的基本流程

以常規 HPLC 柱為例，流程大致如下：

1. 準備柱管和篩板

要求：

柱管內壁干凈；

篩板無堵塞；

端頭密封良好；

柱管內無劃痕、無顆粒殘留。

篩板孔徑一般要小于填料粒徑，例如：

5 μm 填料常用 2 μm 或 0.5–2 μm 篩板；

3 μm 填料常用更細篩板；

大顆粒制備填料可用 5–10 μm 篩板。

2. 選擇勻漿溶劑

勻漿溶劑非常關鍵，應滿足：

能良好潤濕填料；

不溶解或破壞固定相；

與填裝液兼容；

不導致填料團聚；

黏度適中；

容易排氣。

常見勻漿溶劑包括：

甲醇；

乙腈；

異丙醇；

水；

甲醇/水；

異丙醇/水；

正己烷/異丙醇，正相填料常用；

特定鹽溶液，離子交換樹脂可能需要。

不同填料差異很大，最好參考廠家推薦。

3. 制備填料勻漿

把一定量填料加入勻漿溶劑中，形成均勻懸浮液。

注意：

填料不能結塊；

可輕輕超聲脫氣，但避免破壞軟膠；

可磁力攪拌，但不宜過猛；

填料應完全潤濕；

勻漿濃度要合適，太稀填裝慢，太濃容易堵塞或不均勻。

4. 裝柱

將勻漿倒入填裝罐或柱管中，然后連接填裝泵。

裝柱時要避免：

引入氣泡；

勻漿沉降；

填料掛壁；

柱管內斷流；

壓力突然沖擊。

5. 加壓填裝

通過高壓泵或氣動泵使填料進入柱管并壓實。

一般原則：

先低流速排氣；

再逐漸升壓；

達到設定填裝壓力后保持一段時間；

壓力應高于實際使用壓力；

填裝完成后不能突然卸壓。

例如常規不銹鋼 HPLC 柱可能需要較高填裝壓力；而軟膠、蛋白純化填料只能低壓填裝。

6. 截平柱床并安裝上端篩板

填裝完成后，柱床頂部應平整、無裂紋、無凹陷。

如果柱床回縮或頂部有空隙，會導致：

峰拖尾；

柱效下降；

分離度變差；

重現性差。

安裝端頭時要避免擾動柱床。

7. 平衡和測試

填裝后需要用適當流動相沖洗和平衡，然后測試：

柱壓；

理論塔板數；

峰對稱因子；

保留時間；

分離度；

重現性。

如果柱效低、峰拖尾嚴重或壓力異常，說明填裝可能存在問題。

六、填裝壓力和使用壓力

一個重要原則：

填裝壓力通常應高于實際使用壓力。

這樣柱床在后續使用中不容易繼續壓縮或塌床。

例如：

常規分析柱使用壓力 10–25 MPa；

填裝時可能需要 30–60 MPa，具體取決于柱規格和填料；

制備柱填裝壓力通常低于分析柱，但也要高于正常使用壓力；

軟膠填料則不能高壓，否則會壓壞顆粒。

注意：具體壓力必須依據柱管、篩板、填料和設備耐壓確定，不能盲目加壓。

七、影響填裝質量的關鍵因素

1. 填料粒徑分布

粒徑越均一，柱效越好。

如果粒徑分布太寬，容易導致：

柱壓升高；

流路不均；

柱效下降。

2. 勻漿溶劑選擇

溶劑不合適會導致：

填料團聚；

固定相溶脹或收縮；

柱床不穩定；

填裝不均勻。

3. 填裝壓力

壓力太低：

柱床松；

后續容易塌床；

峰形差。

壓力太高：

填料破碎；

篩板堵塞；

柱壓異常升高；

軟膠變形。

4. 填裝流速

流速太低：

填料容易沉降分層；

柱床不夠緊密。

流速太高：

容易形成湍動；

壓力沖擊大；

可能導致填料破碎或柱床不均。

5. 氣泡

氣泡是填裝大忌。

氣泡會造成：

柱床空洞；

通道效應；

峰分裂；

保留時間不穩定；

柱效明顯下降。

所以溶劑和勻漿都應充分脫氣。

6. 柱管內壁

內壁粗糙或污染會造成壁效應，使流速分布不均，影響柱效。

八、填裝不良的表現

如果色譜柱填裝不好，常見現象包括：

1. 柱效低

理論塔板數明顯低于預期。

原因可能是：

柱床不均勻；

填料粒徑分布差；

柱床太松；

存在氣泡或空隙。

2. 峰拖尾

可能原因：

柱頭有空隙；

篩板污染；

填料表面活性點過多；

柱床分布不均。

3. 峰前伸

可能原因：

進樣過載；

柱床過緊或存在局部通道；

樣品溶劑太強；

柱頭結構異常。

4. 雙峰或峰分裂

常見原因：

柱床裂隙；

柱頭空洞；

篩板安裝不良；

入口處流體分布不均。

5. 柱壓異常高

可能原因：

篩板堵塞；

填料太細或破碎；

填裝過緊；

填料團聚；

流動相黏度過高。

6. 柱壓異常低

可能原因：

柱床太松；

柱內有通道；

填料量不足；

端頭漏液。

九、不同類型柱的填裝注意點

1. 反相 C18/C8 柱

這是最常見的 HPLC 柱。

注意：

填料要充分潤濕；

避免氣泡；

柱床要高壓壓實；

保存液一般為高比例甲醇或乙腈水溶液；

普通 C18 長期不要保存在純水中。

2. 正相硅膠柱

注意：

避免水分過多；

常用正己烷/異丙醇等體系；

填裝和使用溶劑要兼容；

從極性溶劑切換到非極性溶劑時要逐步過渡。

3. 離子交換柱

注意：

填料可能會因鹽濃度、pH、離子型不同而溶脹或收縮；

填裝前要確定樹脂狀態；

有些樹脂需要預處理或轉型；

不能簡單套用 C18 柱的高壓填裝方法。

4. SEC/GPC 柱

尺寸排阻柱對柱床均勻性要求非常高。

注意：

不能壓得過緊，否則孔結構和分離范圍受影響；

溶劑必須與填料完全兼容；

避免突然升壓和流速沖擊；

不能讓柱床干涸。

5. 蛋白純化軟膠柱

如瓊脂糖、葡聚糖、親和層析填料。

注意：

低壓填裝；

避免氣泡；

避免填料干裂；

填裝后常需測柱效和不對稱因子；

壓縮因子要按廠家推薦，例如 1.10、1.15 或 1.20 等。